Bakteriler birçok doğal bağışıklık sistemine sahiptir. Bunlardan biride genetik yapılara karşı kazanılmış bağışıklık sağlayan CRISPR-Cas adaptif immün sistemidir. CRISPR sistemi, bakteriler ve arkeler tarafından istilacı DNA öğelerini virüs ve fajdan ayırmak ve yabancı maddelere karşı bağışıklık kazanmasını sağlar. Buna ek olarak, gen regülasyonu ve genom düzenlenme rollerini de üstlenene sistem Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) ve CRISPR dizilerine bitişik bulunan ve immün yanıt için proteinleri kodlayan CRISPR ilişkili (Cas) genlerden oluşur[1]. Cas proteinleri helikazlar, nükleazlar ve RNA bağlanma proteinleri gibi nükleik asitlere etkileşimde bulunan çok çeşitli proteinlerdir. Bütün CRISPR-Cas sistemlerinde bulunan Cas1 ve Cas2 proteinleri adaptasyonda rol oynar[2]. Diğer Cas proteinleri ise sadece belirli tipte CRISPR-Cas sistemleri ile ilişkilidirler. Cas genlerinin içeriği ve CRISPR bölgesinin organizasyonuna göre CRISPR-Cas sistemi üç ana tipe ayrılır. Bunlar tip I, tip II ve tip III. Cas proteinlerin cRNA sentezini, istilacı nükleik asitlerin tanınması ve yıkımında sorumludur. Bu sorumluluklardan kaynaklı CRISPR tiplerinin moleküler mekanizmaları farklılık gösterir. Tip I ve III’te, pre-crRNA’nın transkripsiyonu ve tekrarlar içindeki ilk işleme olayını Cas6 ailesinden bir protein veya alternatif olarak Cas5d tarafından katalize eder. Tip I sisteminde, oluşan crRNA molekülü Kaskat ve Cas3 proteinleri ile birleşerek yabancı DNA’yı kesmektedir. Pre-crRNA’dan oluşan crRNA Cmr/Cas10 veya Csm/Cas10 proteinleri ile kompleks oluşturan sistem tip III dür ve bu kompleks ile Cas proteinleri yabancı DNA’yı kesmektedir[3]. TipII de ise Sistemin verimliliği ve basitliği dikkate alındığında Cas9 proteinleri genom düzenlemede yaygın olarak kullanılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan Cas9, Streptococcus pyogenes’dur (SpCas9). Cas9, trans-etkili crRNA (tracrRNA) ve crRNA ile bir ribonükleoprotein kompleksi oluşturup istilacı DNA’yı tanıyıp kesmektedir. CRISPR-Cas9’dan biraz daha ayrıntılı bashetmek gerekirse, crRNA’nın 20 nükleotitten oluşan tanıma kısmı DNA’da istediği yeri hedeflemeyi sağlar. Trans-activating crRNA (tracrRNA) crRNA’nın olgunlaşmasını sağlar ve crRNA’nın işini yapmasına kolaylık sağlar. tracrRNA ve crRNA birleştirilmesiyle kodlanamayan kısa RNA dizileri oluşur[4]. Bu birleşme işlemi esnasında RNA polimeraz II ve III promotörleri görev alır. Bu RNA dizilerine rehber RNA (gRNA) denir. gRNA, Cas9 enzimine bağlanır ve sistemin hedefleme özgüllüğünü sağlar. Bir gRNA, hedef lokusa özgü özelleştirilmiş bir 20 nükleotid protospacer olarak da bilinen hedefleme dizisinden ve Cas9 bağlanmasını kolaylaştıran değişmez bir iskele dizisinden meydana gelir[5]. Cas9 aracılı DNA ayrılmasında önemli bir ön koşul ise hedef gen üzerinde spesifik bir Protospacer Bitişik Motifin (PAM) varlığıdır. 2-6 nükleotitten oluşan PAM sekansları korunmuş dizi motifleridir. PAM sekansı olmadan Cas9 proteini istenen bölgeyi tanımayacaktır. PAM sekansının yaklaşık 3bp yukarısında Cas9 tarafından DNA kesimi gerçekleştirilir[6]. Cas9’nın PAM dizisi ise NGG’dir [7]. İnsan genomu içerisinde ortalama olarak her 8-12 bp’da PAM sekansları mevcuttur. Bu durum, CRISPR / Cas9 aracılı gen düzenleme için geniş bir hedefleme spektrumu ortaya çıkartır. Hedefleme sağlandıktan sonra Cas9 ile homolog sekanslar kesilerek işlem tamamlanır. SgRNA-Cas9 kompleksinin neden olduğu kesilme işleminden sonra çift iplik kırılmasının (Double Strand Break-DSB) verimli ve doğru onarımı genom stabilitesi için önemlidir. DSB’lerin onarımı iki farklı yolla gerçekleşir: Homolog Olmayan Son Birleştirme (NHEJ) ve Homoloji Yönlendirmeli Onarım (HDR).
Şekil 1: Cas9 RNA kılavuzlu nükleaz sistemi [4].
Hücre döngüsü boyunca aktif olan NHEJ bir onarım şablonu ve kapsamlı DNA sentezi gerekmediğinden yüksek bir onarım kapasitesine sahiptir ve CRISPR/Cas9 ile ortaya çıkan kırılmaların onarılmasında temel bir yoldur. Homolog olmayan olarak anılan NHEJ, homolog bir şablona ihtiyaç duymadan kırılma uçlarını doğrudan bağlanır. Cas9 sonucunda oluşan kırılmalarda amaç ilgilenilen gende bir nakavt oluşturmaksa indel hataları oluşturmaya yatkın NHEJ aracılı onarım yapılır. NHEJ tarafından yapılan onarımlar sırasında meydana gelen indel hataları küçüktür fakat son derece heterojendir. Sonuç olarak protein çevirisinin, transkript degradasyonunun ve protein kaybının erken sonlandırılmasına neden olan çerçeve kayması mutasyonlarına sebep olması üçte iki oranı kadardır[8]. Hücrede çift iplikçi kırılmaları tamir etme için kullanılan en yaygın form homolog rekombinasyondur. Homoloji yönlendirmeli tamir (Homology directed repair- HDR) doğal olarak oluşan bir nükleik asit onarım sistemidir. İnsanlar dahil olmak üzere birçok organizmada genomları değiştirmek için kullanılabilir. Mekanizma genellikle G2 ve S fazında sadece çekirdekte tamiri yapılacak DNA’ ya homolog bir DNA parçası varlığında çalışır fakat bu homolog parça yoksa NHEJ sistemi devreye girer. NHEJ tamir mekanizma HDR tamir mekanizmasına göre daha hızlı olmasına rağmen DNA’nın hasarlı ve sağlam donör zincirler arasında daha yüksek sekans homolojisi gerekliliği nedeniyle HDR onarım mekanizması tercih edilir[9].
Verimli ve kalıcı gen delesyonu sağlayan CRISPR / Cas9 teknolojisi, gRNA’larin hızlı tasarımı ve yapımı çinko parmak nükleazları veya transkripsiyon-aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALEN’ler) gibi daha fazla emek gerektiren ve maliyetli genom düzenleme araçlarına göre avantaj sağlar[10].
REFERANSLAR
1-Ma, Y., Zhang, L., & Huang, X. (2014). Genome modification by CRISPR/Cas9. The FEBS journal, 281(23), 5186–5193. https://doi.org/10.1111/febs.13110
2-McGinn, J., & Marraffini, L. A. (2019). Molecular mechanisms of CRISPR-Cas spacer acquisition. Nature reviews. Microbiology, 17(1), 7–12. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0071-7
3-Charpentier, E., Richter, H., van der Oost, J., & White, M. F. (2015). Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity. FEMS microbiology reviews, 39(3), 428–441. https://doi.org/10.1093/femsre/fuv023
4- Doetschman, T., & Georgieva, T. (2017). Gene Editing With CRISPR/Cas9 RNA-Directed Nuclease. Circulation research, 120(5), 876–894. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.116.309727
5- Jiang, F., & Doudna, J. A. (2017). CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual review of biophysics, 46, 505–529. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822
6- Amitai, G., & Sorek, R. (2016). CRISPR-Cas adaptation: insights into the mechanism of action. Nature reviews. Microbiology, 14(2), 67–76. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2015.14
7- Nishimasu, H., Cong, L., Yan, W. X., Ran, F. A., Zetsche, B., Li, Y., Kurabayashi, A., Ishitani, R., Zhang, F., & Nureki, O. (2015). Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell, 162(5), 1113–1126. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.08.007
8- Blogger, G. (2020). CRISPR 101: Non-Homologous End Joining. Blog.addgene.org. Retrieved 23 October 2020, from https://blog.addgene.org/crispr-101-non-homologous-end-joining.
9-Cortez, C. (2020). CRISPR 101: Homology Directed Repair. Blog.addgene.org. Retrieved 23 October 2020, from https://blog.addgene.org/crispr-101-homology-directed-repair.
10- Gün Gök, Z , Çağdaş Tunalı, B . (2016). Biology, Mechanism and Applications of CRISPR-Cas Immune System . International Journal of Engineering Research and Development , 8 (2) , 11-21 . DOI: 10.29137/umagd.346148
