Bugün, moleküler biyoloji teknolojilerinin çoğunun olmazsa olmazı genlerdir. Gen çalışmalarını kolaylaştırmak için, genler izole edilmeli ve çoğaltılmalıdır. İlgilenilen bir genin izolasyonu ve amplifikasyonu (çoğaltılması) için kullanılan metotlardan biride bu genin bir aracı ya da vektör olarak isimlendirilen ve canlı hücrelerde replike olabilen, bir başka DNA molekülü içerisine insört edilerek klonlanmasıdır. Değişik orijinlerden gelen iki DNA’nın birleştirilmesiyle oluşan sonuç ise rekombinant DNA molekülüdür.
Gen klonlamanın henüz daha keşfedilmediği yıllarda, gen çalışmaları çoğunlukla bakteriyofajların bakteriyel genleri kendi genomlarına yerleştirebilme (inkorpere etme) yetenekleri gibi, dolaylı ya da tesadüfi keşiflere dayanıyordu. Örneğin, Lac represörünün özgül olarak DNA’nın lac operatörüne bağlandığını göstermek için, genomuna lac operatörü yerleştirilmiş olan phi 80 fajının bir suşu kullanılmıştır.Şimdi ise laboratuvarda DNA’yı manipüle edebilmek için gerekli araçların geliştirilmesinde moleküler biyologlara yol göstermiş olan bakteriyofajlardan elde edilen bulgular sayesinde birçok işlem kolaylaşmış haldedir. Krossing-over (çapraz-geçiş) gibi genetik işlemler de teknik olarak rekombinant DNA üretmesine rağmen, bu terim genellikle farklı biyolojik kaynaklardan elde edilen DNA segmentlerinin eklenmesi ile türetilen DNA molekülleri için kullanılmaktadır. Rekombinant DNA molekülü, ya ökaryotik ya da prokaryotik bir konak hücreye yerleştirilir. Bu konak hücre ise bir klon üretmek üzere replike olurken, yabancı DNA parçasını barındıran vektör de replike olur. Böylece yabancı DNA sayısal olarak çoğaltılmış olur ve ardından da daha ileri analizler için saflaştırılabilir.
Hamilton Smith ve arkadaşları, restriksiyon endonükleazların özgül bir DNA dizisini kırdığını kesin olarak gösterdikten ve Daniel Nathans’ın Simian 40 virüsünün (SV40) genom haritasını çıkarmak ve replikasyon orijininin yerini belirlemek için restriksiyon endonükleazları kullandıktan sonra bu büyük keşiflerin aslında , DNA çalışmaları için restriksiyon endonükleazların ne kadar önemli olduğunu göstermiş oldu. Bu araştırmacıların keşiflerinin üzerine, Herbert Boyer, Stanley Cohen, Paul Berg ve arkadaşlarının 1970’lerin başında inşa ettikleri klonlama denemeleri ise rekombinant DNA teknolojisi çağını başlatmıştır.
Siz olsaydınız ilk neyi klonlamak isterdiniz ? Sizce tasarlanan ilk rekombinant DNA molekülü ne olmalıydı?
Rekombinant DNA teknolojisi’nin genetik temeli ‘rekombinasyon’ dur. Rekombinant DNA teknolojisi DNA moleküllerinin yapay kombinasyonlarını oluşturur.Rekombinant DNA teknolojisi kısmen DNA parçalarının özgül baz dizilerinden kesilmesi ve bu DNA parçalarının tekrar birleştirilmesi becerisine dayanır.Rekombinant DNA molekülleri genellikle iki farklı kaynaktan gelen DNA’dan,çoğunlukla da farklı türlere ait DNA’dan oluşur. Rekombinant DNA teknolojisinin en yararlı uygulaması ilgilenilen DNA parçasının klonlanmasıdır.
Peki ,klonlama nedir?
Klonlama özgül DNA parçalarının konak hücreler bölünürken rekombinant molekülün de replike olmasının sağladığı konak hücrelere (mesela bakteri hücreleri gibi)aktaran vektörlere (mesela plazmitler gibi) sokulmasıdır.Rekombinant moleküller prokaryotik ya da ökaryotik konak hücrelerde klonlanabilir.Ardından DNA parçaları hızlı ve etkin bir şekilde binlerce kez çoğaltılabilir.Klonalanmış bu DNA parçalarının özellikleri çeşitli yollarla ortaya konabilir,bunlardan en özgül olanı DNA dizi analizidir.Rekombinant DNA teknolojisi,farklı türlere ait genomları araştırma gücümüzde bir devrim yaratmıştır.Tasarlanan ilk rekombinant DNA moleküllerinden biri, λ fajı ile SV40 DNA virüs genomunun oluşturduğu bir hibrit olmuştur ve 1974’te ilk ökaryotik geni klonlanmıştır.
Cohen ve Boyer, Xenopus laevis’den izole ettikleri DNA’yı EcoRI restriksiyon endonükleazı ile kesmişlerdir. Kesilmiş olan DNA parçalarını ise daha sonra açık dairesel yapıda olan pSC101 plazmidi ile karıştırmışlardır. pSC101 DNA’sı ile kesilmiş olan Xenopus laevis DNA’larının birbirine eklenmesini ise DNA ligaz enzimi aracılığı ile gerçekleştirmişlerdir. Daha sonra tetrasikline duyarlı olan E. coli hücreleri ile rekombinant pSC101 plazmidlerini karıştırarak,bakterilerin bu plazmidi almalarını sağlamışlardır. Daha sonra, pSC101 plazmidinin taşıdığı tetrasiklin dirençlilik geni sayesinde, tetrasiklin içeren besiyerinde klonlanmış olan E. Coli hücrelerini seçmişlerdir. pSC101 plazmidini alan rekombinant hücreler arasından Xenopus laevis DNA’sını içeren hücreleri izole etmeyi başarmışlardır. Rekombinant hücreler ise taşımakta oldukları pSC101 plazmidi içerisinde Xenopus laevis DNA’sını da içermektedirler. DNA’yı içeren pSC101 plazmidi böylece, rekombinant DNA teknolojisinin ilk ürünü olarak kayıtlara geçmiştir. Bu plazmid ise doğal olarak bulunmamaktadır. Bu plazmid, rekombinant DNA teknolojisi ile oluşturulmuş ve laboratuvarda gen mühendisleri tarafından bir ökaryot DNA ile prokaryot DNA’yı içeren ilk plazmid olmuştur. Böylece, gen mühendisleri tarafından plazmid DNA’sı içerisinde ökaryot DNA’sı içeren ilk rekombinant genom elde edilmiştir. Bu gelişme ise bu gün çok ilerlemiş bir teknoloji olan rekombinant DNA teknolojisinin kullanılmasına olanak sağlamıştır.
Başarılı Klonlama Yapabilmek İçin Gen;
Ø Bağımsız olarak replike olabilmeli
Ø Konak hücreye kolaylıkla transfer edilebilmeli
Ø Seleksiyona olanak tanımalıdır.
Rekombinant DNA terimi,doğal olarak bir arada bulunması mümkün olmayan DNA moleküllerinin kombinasyonunu ifade eder. Gerçi, krosover gibi genetik süreçlerde de rekombinant DNA molekülleri oluşturulsa da, rekombinant DNA terimi, daha çok farklı biyolojik kavramlardan elde edilen DNA’ların birleştirilmesi ile elde edilen moleküller için kullanılır.
Rekombinant DNA teknolojisi, bakteri ve virüslerle yapılan çalışmalarda geliştirilen genetik teknikleri ve nükleik asit biyokimyası metotlarını birlikte kullanır. Bu teknoloji, bir genin potansiyel olarak sınırsız miktarda üretilmesi için güçlü bir araçtır. İşin içinde birçok yöntem olsa da, temel işlem aşağıdaki basamakları içerir.
1) Klonlanacak DNA doku ya da hücrelerden izole edilir.
2) Özgül DNA parçalarının oluşturulması için restriksiyon enzimleri denilen proteinler kullanılır.
3) Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçaları, vektör ya da taşıyıcı molekül adı verilen diğer DNA molekülleri ile birleştirilir. Bir DNA parçası ile birleşmiş olan vektör, bir rekombinant DNA molekülüdür.
4) Rekombinant DNA molekülü bir konak hücreye aktarılır. Konak içerisinde rekombinant molekül kendini eşler ve rekombinant molekülün birbirine özdeş düzinelerce kopyası ya da klonları oluşur.
5) Konak hücre kendisini eşlerken, rekombinant DNA molekülleri de tüm yavru hücrelere geçer ve her biri klonlanmış DNA dizisinin kopyalarını taşıyan konak hücre topluluğu oluşur.
6) Klonlanmış DNA konak hücrelerden izole edilebilir ve incelenebilir.
7) Klonlanmış DNA daha sonra transkripsiyona uğratılabilir, mRNA’sı translasyona sokulabilir ve kodlanan gen ürünü izole edilerek araştırma için ya da ticari amaçlarla satılmak için kullanılabilir.
Gen Klonlaması ise işte bu yöntemlerle yani bir organizmadan elde edilen ve içinde istenilen geni taşıyan DNA parçalarının taşıyıcı özellikte bir DNA molekülüne (vektör) bağlanarak rekombinant DNA oluşturulması ile oluşan bu Rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokularak orada çoğaltılması ve hepsi birbirinin aynı olan bir DNA popülasyonunun elde edilmesidir. Konak hücreler çoğaldıkça rekombinant DNA molekülleri nesillere geçerler ve oğul hücrelerde de kopya sayılarını artırırlar. Çok sayıda hücre bölünmesiyle oluşan bir klon (rekombinant DNA teknolojisi ile sentezlenen belirli DNA/gen kopyaları) da hücrelerin her birinde istenilen geni taşıyan rekombinant DNA moleküllerinin bir ya da daha fazla sayıda kopyası bulunur.
Özellikle 1970’li yıllardan sonra yapılan çalışmalar sonucunda genetik materyalinizolasyonu, manipülasyonu ve ekspresyonunu sağlayan ileri tekniklerin geliştirilmesi ise bugün,bu tekniklerin uygulama alanı olan gen mühendisliğinin doğmasına neden olmuştur.
Gen mühendisliği ise hem temel hem de uygulamalı alanlarda araştırmaların yapılmasına olanaklar sağlamaktadır. Temel araştırmalarda gen mühendisliği teknikleri prokaryotlarda, ökaryotlarda ve bunların virüslerinde gen replikasyon ve ekspresyon mekanizmalarının araştırılmasında kullanılmaktadır.
Rekombinant DNA teknolojisi ile geliştirilen ürünlere protein ve hormon üretimi, gen terapisi, antikor ve türevlerinin üretimi ve meyvelerde tıbbi açıdan önemli bileşiklerin üretimi örnek olarak verilebilir. Protein ve hormon üretimine verilebilecek en klasik örnek insülin ilaçlarıdır.
Diyabet hastalıklarının (tip 1 ve 2) sebebi olan insülin hormonu eksikliği ya da yokluğuna karşın insülin üretiminin kolaylaştırılması amacıyla rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak, insülin üretiminde ilk defa 1978-1981 yılları arasında adımlar atılmıştır. İnsan insülin hormonunun geni kimyasal olarak sentezlendikten sonra, rekombinant DNA teknolojisi ile insülin geni Escherichia coli bakterisinde ifade edilmiştir. Escherichia coli üzerindeki ifadesinden bir yıl sonra 1981’de ise bu bakteride ifade edilen insülin hormonunun insan insülin reseptörleri ile etkileşime geçebildiği ve ilaç amaçlı kullanılabileceği ortaya çıkartılmıştır. Rekombinant DNA teknolojisi uygulamalı alanlarda insüline ek olarak, insan büyüme hormonları, interferon, aşı ve endüstriyel enzimler gibi önemli ürünlerin mikrobiyal kültürler ile üretilmesini sağlayan gelişmelere yol açmıştır.
Rekombinant DNA teknolojisi Genom Analizi nin Temelidir
Rekombinant DNA ve gen-klonlama teknolojisi bilim adamlarına, büyük ve karmaşık genomlardan özgül genleri ya da diğer DNA dizilerini çeşitli yöntemlerle büyük miktarlarda elde etme olanağı tanır. Örneğin insan genomu, 3 milyarın üzerinde nükleotit ve 25.000 ila 30.000 civarında gen içerir. Restriksiyon enzimleri genomu, izole edilebilen, kopyalanabilen, ayrı ayrı çalışabilen, üzerinde oynanabilen küçük parçalara böler. Bu durum, araştırmacılara; gen organizasyonunu,fonksiyonunu, gen ifadesini düzenleyen faktörleri, genler tarafından şifrelenen proteinlerin işlevlerini ve doğasını birçok yönden araştırmalarına olanak sağlar. Bu teknolojiyi tartışmaya rekombinant DNA molekülünü oluşturmak için gerekli olan iki önemli ana bileşeni ele alarak başlayacağız.
Ayrıca rekombinant DNA teknolojisi, üretici organizmanın ve/veya ürün kalitesinin iyileştirilmesi, üretimin artırılması, maliyetin azaltılması bakımından da çok önemlidir.Sınırsız bir potansiyele sahip olduğu görülen ve ticari amaçla değerli ürünlerin üretilmesini sağlayan gen mühendisliği uygulamaları ise günümüzde biyoteknoloji olarak adlandırılmaktadır. Biyoteknoloji ise öncülüğünü ve ağırlığını sağlık ve tarım sektörlerinin üstlendiği pek çok alanda uygulama olanakları bularak, çok önemli bir biyoendüstri ve biyoekonomi oluşturmuştur.
Günümüze kadar birçok ilacın, aşının veya tedavinin yollarını rekombinant DNA teknolojisi açmıştır .Bunun yanı sıra moleküler biyoloji ve genetik dallarının da gelişmesinde çok önemli bir role sahiptir. Günümüzde ise birçok projede kullanılmaktayken, bu projelerin bir kısmında tedavi amaçlı ilaç ve aşı geliştirmesinde kullanılmakta, bir kısmında ise temel moleküler biyoloji ve genetik araştırmalarında araç olarak kullanılmaktadır. İlerleyen bilim sayesinde rekombinant DNA teknolojisi gün geçtikçe gelişmekte ve geliştirilmektedir.
KAYNAKLAR
—————————————————————————————————————————
-Genetik Kavramlar, William S. Klug , Michael R. Cummings, Palme Yayınevi, 2012
-Introduction to Biotechnology (3rd Edition) 3rd Edition by William J. Thieman (Author), –Michael A. Palladino (Author)
-http://guncel.tgv.org.tr/journal/69/pdf/100515.pdf
-https://www.youtube.com/watch?v=OpU_CQ0pFyQ
-https://www.youtube.com/watch?v=Jv2Pq2rkNk8
